Трансгенные животные примеры, Трансгенные растения — спасители планеты или бомбы замедленного действия?
![Трансгенные животные примеры](https://ank-ugra.ru/wp-content/themes/mh-magazine-lite/images/zynexub.jpg)
В некоторых аспектах сайты сайт-специфической рекомбинации можно ввести в интроны, а не в кодирующие области нуклеиновой кислоты или регуляторные последовательности. С течением времени причины модификации генов рыбы менялись. Количественный анализ проводили на 4-й день в культуре.
Затем в нее вводят ядро соматической клетки того животного, которое надо клонировать. Создают условия, при которых такая бывшая яйцеклетка а теперь псевдозигота , начнет делиться.
Как известно, деление зиготы дробление — это начало развития эмбриона. Такие эмбрионы переносят в матку суррогатной матери. При удачной трансплантации в стенку матки эмбрион будет развиваться, как обычный плод. В результате родится детеныш — точная генетическая копия того организма, из клетки которого было взято ядро.
Клонировать можно и нужно! В современном животноводстве давно и успешно применяется искусственное осеменение. Для получения высокопродуктивных животных определенной породы используется сперма самцов-производителей. Во множестве хозяйств такой спермой искусственно оплодотворяют половозрелых самок. Производителями называют тех животных, в генотипе которых обязательно и желательно в гомозиготном состоянии присутствуют гены, которые определяют основные породные признаки. Потомки, получаемые от таких производителей, наследуют только половину их высокоценного генотипа.
Клонирование же такого производителя может дать точную копию, сохраняющую весь генотип. Например, в г. В рамках генетической инженерии животных ведутся работы не только по млекопитающим.
Разрабатываются более эффективные методы получения трансгенных птиц и рыб. В селекционной работе с сельскохозяйственной птицей основными направлениями являются получение пород с улучшенным составом мяса и яиц, а также пород, устойчивых к инфекционным заболеваниям. Проводятся эксперименты по созданию птиц-биореакторов, в яйцах которых белок птичий альбумин был бы частично заменен на белок медицинского или ветеринарного назначения.
Для выведения пород рыб также используются методы генетической инженерии. Один из проектов данного направления уже реализован. Результатом этого стало создание лосося, растущего в 2 раза быстрее, чем рыбы исходной породы рис. Еще одним достижением генетической инженерии рыб стало создание пород светящихся в темноте аквариумных рыбок.
Для этого были использованы гены медуз и кораллов, которые кодируют светящиеся белки разных цветов рис. Перейти к основному содержанию. Боковая панель. Вы используете гостевой доступ Вход. Печатать книгу. Печатать эту главу. Трансгенные животные. Генодиагностика и генотерапия. Клеточная инженерия. Трансгенные организмы — будущее современной биотехнологии. Трансгенные бактерии и грибы. Трансгенные растения. Перейти на У такой мыши отставание в росте заметно с пятидневного возраста, а взрослые животные достигают приблизительно половины нормальной мыши.
Поскольку введение гена гормона роста восстанавливало рост, то ученые решили исправить карликовость с помощью генной терапии. Сначала они вводили в яйцеклетку карликовой мыши чистые гены гормона роста крысы или человека.
Рост не восстанавливался. Когда же они ввели в яйцеклетку дополнительно ген-регулятор, то карликовая мышь вырастала до нормальной. Казалось бы, такой успех можно перенести на лечение подобного заболевания у людей. Но придется разочаровать читателей: делать этого пока нельзя.
Причин несколько. Одна из них связана с низкой эффективностью техники гемотерапии. Во-первых, только один процент яйцеклеток с введенным чужим геном развивается в мышь, у которой усилено действие гормона роста. Во-вторых, пока практически невозможно предвидеть, в какое место встроится чужеродная молекула ДНК, и потому-то невозможно гарантированно заменить поврежденный ген нормальным.
Более того, вводимый ген может попасть «не туда» и разрушить какой-нибудь нормальный ген, то есть даст результат, обратный желаемому. Таким образом, эти примеры показывают, что использовать предлагаемые способы для лечения больных людей еще невозможно. Чтобы вмешиваться в наследственность человека, по крайней мере необходимо знать полностью генотип человека.
Наука пока далека от этого. Однако первые успехи на этом пути, хотя и очень малые, воодушевляют ученых на дальнейшие поиски. Наконец, еще одна область возможного использования трансгенных животных — это повышение количества и качества продукции сельскохозяйственных животных. Так, сам по себе ускоренный рост трансгенных животных, видимо, позволяет увеличить выход мяса.
Но, кроме того, есть ведь и возможность пока теоретическая, конечно ввести, скажем, в корову ген необходимого продукта и заставить его работать в молочных железах, а продукты гена выделять потом из молока. Со временем люди научатся получать таким образом лекарственные препараты — интерферон, инсулин, гормон роста и другие нужные вещества. Словом, сельскохозяйственные животные смогут нести те или иные конструкции генов и превратятся в живые фабрики биологически и химически важных пептидов и белков.
Все это звучит сейчас слишком фантастично, однако фантазия нередко переходит в реальность. И кто знает, может быть, для людей будущего станут обычными названия специализированных хозяйств — например, совхоз «сахарных» коров, то есть трансгенных коров, молоко которых содержит большое количество сахара.
С другой стороны, техника получения трансгенных животных, видимо, может помочь быстрее переносить полезные свойства одной породы к другой, то есть ускорить выведение новых высокопродуктивных пород животных.
Это откроет невиданные горизонты перед сельскохозяйственной генетикой и селекцией. Как видим, можно констатировать, что биология вступила в период реального воплощения заветной мечты человечества— направленного изменения высших организмов.
Не за горами будущее — конструирование геномов животных и растений. Однако тут обычно возникает очень серьезный вопрос, интересующий, кстати, многих наших читателей: не опасны ли генноинженерные манипуляции с ДНК для человека, животных и растений? Ведь в результате таких манипуляций могут появиться организмы с совершенно новыми генетическими качествами, ранее не существовавшими на Земле.
И если они выйдут каким-либо образом из-под контроля, распространятся в природе, то это может вызвать нежелательные изменения в генетическом аппарате земных организмов — врожденные пороки, уродства и т.
Поэтому еще на заре генной инженерии, в середине х годов, группа исследователей обратилась к ученым всего мира с призывом наложить мораторий на генетические эксперименты в наиболее опасных для человека направлениях исследований. А затем, в феврале года, в США была созвана международная конференция, на которой присутствовало ученых из 17 стран, в том числе и из Советского Союза.
Работе этой конференции стала первым в истории мировой науки примером принятия мер предосторожности до, а не после того, как возникла опасность: на ней был объявлен запрет ни проведение особо опасных экспериментов до разработки соответствующих мер предосторожности.
После конференции исследования по генной инженерии были несколько переориентированы. В качестве объектов для генетических манипуляций были взяты только те микроорганизмы, которые неспособны населять кишечный тракт человека, не выживают в половых клетках и легко уничтожаются обычными моющими средствами.
Затем в нашей стране так же, как и в других странах были приняты правила безопасности работ с рекомбинантными составными молекулами ДНК.
В чем же заключаются эти правила? Они, в частности, включают некоторые общие требования безопасности: работу необходимо проводить в специальной одежде и специальными инструментами, не разрешается курить, хранить и принимать пищу в рабочих помещениях, отходы, содержащие рекомбинантные молекулы, помещаются в специальную посуду и обеззараживаются и т.
Кроме того, применяются меры физической и биологической защиты различных степеней — в зависимости от величины предполагаемой опасности эксперимента. Так, средний уровень физической защиты ФЗ требует проводить эксперименты в лаборатории, имеющей специальные инженерные конструкции, герметичное помещение и защитное оборудование.
Воздух из лаборатории выводится по самостоятельным воздуходувам после очистки на фильтрах.
![Трансгенные животные: самые актуальные и выдающиеся примеры в мире](https://aif-s3.aif.ru/images/023/421/8d25916faaa35a5faa116bf5c137ccbd.jpg)
Работа с открытыми сосудами, в которых содержится материал с носителем рекомбинантных ДНК, обязательно проводится в боксах с пониженным давлением. Лабораторную одежду нельзя носить вне лаборатории ФЗ, она должна обеззараживаться до отправки в прачечную. Перед выходом из лаборатории персонал обязан мыть руки с использованием дезинфицирующих средств и т.
Высший уровень физической Защиты Ф4 применяется к работам с микроорганизмами, потенциально опасными для человека, животных и растений. Эксперименты могут проводиться только в помещениях особой конструкции — в отдельном здании или в полностью изолированном от других помещений отсеке общего здания. Инженерные особенности такой лаборатории: монолитные стены, полы и потолки, в которых все технические отверстия для воздушных каналов, электропроводки, трубопроводных коммуникаций герметизируются.
![Трансгенные животные](https://pravo-wmeste.ru/wp-content/uploads/2013/01/Transgennyiy-porasyonok.jpg)
Лаборатория должна иметь отдельную вентиляционную систему, поддерживающую отрицательное давление воздуха до выхода его в атмосферу, воздушные шлюзы, через которые могут безопасно доставляться в помещение предметы оборудования, посуда, животные и материалы.
Вход в лабораторию разрешается только тем лицам, чье присутствие предусмотрено программой исследования. Работы должны выполняться в боксах с вытяжной вентиляцией и фильтрами.
Доступ в эти боксы возможен лишь из рабочих помещений лаборатории. Важным элементом правил являются биологические меры защиты, разрешающие использовать только такие микроорганизмы, биологические свойства которых исключают их распространение и выживание в окружающей среде.
В частности, категорически запрещается использовать для получения рекомбинантных молекул ДНК бактерии и вирусы, патогенные для человека, сельскохозяйственных животных и растений. Тем более не разрешается преднамеренное введение в рекомбинантные молекулы генов, заведомо опасных для здоровья и благополучия человека, и преднамеренное распространение новых рекомбинантных молекул в окружающей среде.
Здесь перечислена, понятно, только часть защитных мер. При желании с ними можно подробней познакомиться в книге «Итоги науки и техники. Молекулярная биология», том 12, часть II, Москва, г. Надо сказать, что со временем — по мере накопления знаний и развития техники генной инженерии — потенциальная опасность подобных экспериментов оказалась преувеличенной, и сейчас правила работы с рекомбинантными молекулами пересматриваются с целью снятия некоторых ограничений.
Это позволит расширить возможности исследований — при прежнем, максимальном уровне езопасности. Читайте в любое время. Другие статьи из рубрики «Наука.
Вести с переднего края». Читайте в номере. Факт дня Червяги кормят детёнышей «молоком». Адрес: г. Москва , ул. Конкретные иллюстрации подходящих методов можно найти при обращении к примерам, представленным в данном документе.
Однако, конечно, также можно использовать другие равноценные обычные методы. Такие широко известные методы и протоколы можно найти в обычных лабораторных руководствах, таких как Green et al. Freeman, New York N. Freeman Pub.
Следует обратить внимание, что в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа «a», «an» и «the» включают множественные формы, если по контексту четко не указано иначе.
Таким образом, например, обращение к «локусу» относится к одному или более локусам, и обращение к «способу» включает обращение к эквивалентным стадиям и способам, известным специалистам в данной области и т. Если не указано иначе, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ для сведения в целях описания и раскрытия устройств, формуляций и методологий, которые можно использовать по отношению к описанному изобретению.
В тех случаях, когда приводятся пределы значений, то понятно, что каждое промежуточное значение, находящееся между верхней и нижней границей такого предела и любое установленное или промежуточное значение в указанных пределах, включается в изобретение.
Верхняя и нижняя границы данных более узких пределов могут независимо включаться в более узкие пределы, и они также включаются в объем изобретения, в зависимости от любой специально исключенной границы в указанных пределах. В тех случаях, когда указанные пределы включают одну или обе границы, то они также включаются в объем изобретения. В последующем описании приводятся многочисленные конкретные детали для обеспечения полного понимания настоящего изобретения.
Однако специалистам в данной области, очевидно, понятно, что настоящее изобретение может практиковаться без одной или более таких конкретных деталей. В других случаях хорошо известные признаки и способы, хорошо известные специалистам в данной области, не были описаны во избежание неопределенностей в описании изобретения. В гуморальной иммунной системе продуцируется репертуар различных антител посредством комбинаторного и соединительного разнообразия локусов генов цепей IgH Igh и IgG Igl в процессе, названном V D J-рекомбинацией.
В развивающейся В-клетке первое рекомбинационное событие, которое должно произойти, находится между сегментами одного D-гена и одного J-гена локуса тяжелой цепи, и ДНК между этими двумя генами делецируется. После такой D-J-рекомбинации происходит объединение одного V-гена из области выше вновь образовавшегося DJ-комплекса, с формированием реарранжированного V D J-гена. Все другие гены между сегментами V и D нового V D J-гена уже на этот момент делецированы из генома отдельной В-клетки.
Такой реарранжированный ген в конечном счете экспрессируется на поверхности В-клетки в виде IgH-полипептида, который связывается с IgL с образованием рецептора В-клетки. Мышиные и человеческие локусы Ig являются очень сложными, простираясь по области размером примерно 2 млн. Настоящее изобретение относится к клеткам позвоночных животных, отличных от человека, содержащим введенную частично человеческую нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующие области человеческих вариабельных областей и некодирующие последовательности из генома позвоночного животного-хозяина, например мышиные геномные некодирующие последовательности, когда млекопитающее-хозяин является мышью.
Такая частично человеческая нуклеиновая кислота позволяет трансгенному животному продуцировать репертуар тяжелых цепей, содержащих человеческие V H области, в то время оставляя регуляторные последовательности и другие элементы, которые можно найти в промежуточных последовательностях в определенном геноме хозяина, которые помогают осуществлять эффективную продукцию антител и узнавание антигена. Настоящее изобретение относится к применению синтетической или рекомбинантно продуцированной частично человеческой области, содержащей человеческие кодирующие последовательности и «нечеловеческие» некодирующие последовательности из локуса V H.
Поскольку способы по изобретению могут иметь преимущество обеспечения двух или более групп сайтов сайт-специфической рекомбинации в сконструированном геноме, то стадия рекомбинация позволяет провести многочисленные вставки в частично человеческий локус. В предпочтительных аспектах изобретения такая частично человеческая область, предназначенная для введения в клетку позвоночного животного-хозяина, содержит все или достаточное число известных генов V H человека.
Однако в некоторых случаях может быть желательным использовать подгруппу таких генов V H , и в конкретных случаях можно использовать даже одну человеческую кодирующую последовательность V H , в клетках и животных по изобретению. Предпочтительные аспекты изобретения включают млекопитающих и клетки млекопитающих, отличных от человека, содержащих частично человеческий локус иммуноглобулина, который включает гены V H человека и дополнительно включает кодирующие области D- и J-генов и пре-DJ-области, основанные на эндогенном геноме млекопитающего-хозяина, отличного от человека.
В некоторых аспектах введенная частично человеческая область может содержать один или более полностью рекомбинированных V D J-сегментов.
В конкретном аспекте изобретения трансгенное млекопитающее, отличное от человека, содержит введенную нуклеиновую кислоту, включающую многочисленные гены V H человека с промежуточными последовательностями, основанными на промежуточных последовательностях, находящихся в локусах млекопитающего-хозяина, отличного от человека, и кодирующие последовательности D- и J-генов человека.
В особенно предпочтительном аспекте частично человеческая нуклеиновая кислота содержит гены V H человека, пре-D-область, основанную на геноме млекопитающего-хозяина, отличного от человека, например геноме мыши, и экзоны D и J человека.
![RU2580017C2 - Трансгенные животные и способы применения - Google Patents](https://www.agroxxi.ru/images/koza-ovca.jpg)
В примерном варианте осуществления, как более подробно описано в разделе «Примеры», полный эндогенный локус VH иммуноглобулина мыши включая локус J делецирован, и экзоны VH локуса J области VH мыши замещаются нуклеиновой кислотой, содержащей 44 из генов V H человека, которые в результате перемежаются с некодирующими областями, которые соответствуют некодирующим последовательностям мыши.
В данном аспекте пре-D-область размером 10 т. Предпочтительно D- и J-области обеспечиваются в виде человеческой кодирующей DJ-области, содержащей D-гены человека и J-гены человека. В способах по изобретению используется комбинация гомологичной рекомбинации и сайт-специфической рекомбинации для получения клеток и животных по изобретению.
Нацеленный на гомологичные участки вектор вначале используется для введения сайтов сайт-специфической рекомбинации в геном млекопитающего-хозяина в требуемом положении в эндогенных локусах иммуноглобулина.
Инсерция сайта сайт-специфической рекомбинации в геномную последовательность посредством гомологичной рекомбинации ассоциированной нацеленной последовательности с геномной ДНК в условиях in vivo предпочтительно не модифицирует аминокислотную последовательность молекулы антитела, которая экспрессируется трансфектированной клеткой. При таком подходе сохраняется правильная транскрипция и трансляция иммуноглобулиновых генов, которые продуцируют требуемое антитело после вставки сайтов рекомбинации и необязательно любой дополнительной последовательности, такой как селектируемый маркерный ген.
Однако в некоторых случаях возможно вставить сайт рекомбиназы и другие последовательности в последовательность локуса иммуноглобулина таким образом, что аминокислотная последовательность молекулы антитела изменяется в результате инсерции, но антитело по-прежнему сохраняет достаточные функциональные свойства для выполнения требуемой цели, и изобретение также включает такие инсерции. В конкретных аспектах изобретения нацеленный на гомологичные участки вектор можно использовать для замещения некоторых последовательностей в эндогенном геноме, а также для введения сайтов сайт-специфической рекомбинации и селектируемых маркеров.
Сайт-специфическая рекомбинация отличается от общей гомологичной рекомбинации в том отношении, что короткие специфические ДНК-последовательности, которые необходимы для узнавания рекомбиназы, являются единственными сайтами, в которых происходит рекомбинация. Для сайт-специфической рекомбинации необходимы специфические рекомбиназы для узнавания сайтов и катализа рекомбинации в этих сайтах. Способ обмена экспрессионными кассетами, опосредованного рекомбиназой RMCE , упрощается при использовании комбинации сайта дикого типа и мутантного сайта loxP или FRT и т.
Но эффективность в этом случае является очень низкой, поскольку в большей степени имеют место реакции вырезания, а не инсерции, и без включения позитивного отбора не будет происходить обогащения соответствующим образом мутированными клетками. Известно, что другие системы на основе тирозинового семейства, такие как интеграза Int бактериофага лямбда, интеграза HK, а также системы, относящиеся к отдельному сериновому семейству рекомбиназ, такие как бактериофаговые интегразы phiC31, R4Tp, функционируют в клетках млекопитающих с использованием их соответствующих сайтов рекомбинации Tronche F.
В способах по изобретению предпочтительно используются сайты сайт-специфической рекомбинации, в которых функционирует одна и та же рекомбиназа, но которая не способствует рекомбинации между сайтами.
Например, сайт Lox P и мутированный сайт Lox P можно интегрировать в геном хозяина, но введение Cre хозяину не будет способствовать рекомбинации двух сайтов; в большей степени сайт Lox P будет рекомбинировать с другим сайтом Lox P, а мутированный сайт будет рекомбинировать только с другим мутированным аналогичным образом сайтом LoxP.
Примеры таких мутированных сайтов рекомбинации включают сайты, которые содержат комбинацию инвертированных повторов, или сайты, которые содержат сайты рекомбинации, имеющие мутантные спейсерные последовательности. Например, имеются две группы вариантных сайтов рекомбиназы для получения стабильной интегративной рекомбинации Cre-loxP.
Оба содержат мутации последовательностей в последовательности узнавания Cre либо в спейсерной области размером 8 п. Мутанты по спейсорной последовательности, такие как lox Hoess R. Данная группа мутантов использовалась для инсерции ДНК посредством обмена экспрессионными кассетами, опосредованного рекомбиназой RMCE , с использованием невзаимодействующих сайтов рекомбинации Cre-Lox и невзаимодействующих сайтов рекомбинации FLP Baer A.
Мутанты на основе инвертированных повторов представляют вторую группу вариантных сайтов рекомбиназы. Например, сайты LoxP могут содержать измененные основания в левом инвертированном повторе мутант LE или правом инвертированном повторе мутант RE.
Мутант LE, lox71, содержит участок размером 5 п. Мутанты на основе инвертированных повторов используются для интеграции плазмидных инсертов в хромосомную ДНК с мутантом LE, сконструированным в виде «целевого» хромосомного сайта loxP, в который рекомбинирует мутантный RE. После рекомбинации сайты loxP располагаются в цис-положении, фланкируя вставленный сегмент. Механизм рекомбинации является таковым, что после рекомбинации один сайт loxP является двойным мутантом содержащим обе мутации на основе инвертированных повторов LE и RE и другой остается сайтом дикого типа Lee L.
Nuleic Acid Res. Двойной мутант в достаточной степени отличается от сайта дикого типа, который не распознается Cre-рекомбиназой, и вставленный сегмент не вырезается. В некоторых аспектах сайты сайт-специфической рекомбинации можно ввести в интроны, а не в кодирующие области нуклеиновой кислоты или регуляторные последовательности.
При этом можно избежать случайного разрыва каких-либо регуляторных последовательностей или кодирующих областей, необходимых для правильной экспрессии антител после вставки сайтов сайт-специфической рекомбинации в геном животной клетки. Введение сайтов сайт-специфической рекомбинации можно достичь обычными методами гомологичной рекомбинации. Cold Spring Harbor, N. Miller, Agnes F. Специфическую рекомбинацию в геноме можно обеспечить с использованием векторов, сконструированных для позитивного или отрицательного отбора, как это известно в данной области.
Для упрощения идентификации клеток, которые подверглись реакции замещения, можно использовать соответствующую систему гена-маркера, и клетки отобрать, например, при использовании селекционной среды. В одном предпочтительном аспекте способов по настоящему изобретению клетки, в которых имело место замещение всего или части эндогенного иммуноглобулина, подвергаются негативному отбору при воздействии токсина или лекарственного препарата.
Например, клетки, которые сохраняют экспрессию HSV-TK, можно отобрать применением аналогов нуклеозидов, таких как ганцикловир. В еще одном аспекте изобретения клетки, содержащие делецию эндогенной иммуноглобулиновой области, можно позитивно отобрать при использовании маркерного гена, который можно необязательно удалить из клеток после или в результате рекомбинантного события. Система позитивного отбора, которую можно использовать, основана на применении двух нефункциональных фрагментов гена-маркера, такого как HPRT, которые сводятся вместе посредством рекомбинантного события.
Такие два фрагмента приводятся в функциональную ассоциацию при проведении успешной реакции замещения, и функционально восстановленный маркерный ген фланкируется с каждой стороны дополнительными сайтами сайт-специфической рекомбинации которые являются другими по сравнению с сайтами сайт-специфической рекомбинации, использованным в реакции замещения , так, чтобы в итоге маркерный ген можно было вырезать из генома с использованием соответствующей сайт-специфической рекомбиназы.
Рекомбиназа может находиться в виде чистого белка или конструкции, временно экспрессированной внутри клетки, для обеспечения рекомбиназной активности. Альтернативно клетку можно использовать для получения трансгенного животного, которое можно скрестить с животным, которое экспрессирует указанную рекомбиназу, для получения потомства, у которого отсутствует маркерный ген и ассоциированные сайты рекомбинации.
В конкретных аспектах изобретение относится к способам получения трансгенных животных, содержащих введенную частично человеческую область иммуноглобулина. В одном аспекте клетка-хозяин, использованная для замещения эндогенных генов иммуноглобулина, представляет собой эмбриональную стволовую клетку ES-клетку , которую затем можно использовать для получения трансгенного млекопитающего. Таким образом, согласно одному аспекту способы по изобретению дополнительно включают: выделение эмбриональной стволовой клетки, которая содержит введенную частично человеческую область иммуноглобулина и применение указанной ES-клетки для получения трансгенного животного, которое содержит замещенный частично человеческий локус иммуноглобулина.
В другом примере трансгенное животное является птицей, и животное получают с использованием примордиальных зародышевых клеток. Таким образом, согласно другому аспекту способы по изобретению дополнительно включают: выделение примордиальной зародышевой клетки, которая содержит введенную частично человеческую область иммуноглобулина и применение указанной зародышевой клетки для получения трансгенного животного, которое содержит замещенный частично человеческий локус иммуноглобулина.
Последующие примеры приводятся для обеспечения специалистов в данной области полным раскрытием и описанием того, как осуществить и использовать настоящее изобретение, и они не предназначаются для ограничения объема того, что рассматривают заявители в качестве их изобретения, также они не предназначаются для того, чтобы представить или подразумевать, что примеры, приведенные ниже являются всеми или только проведенными экспериментами. Следовательно, настоящие варианты осуществления во всех аспектах следует рассматривать в качестве иллюстративных и не ограничивающих.
Были предприняты усилия для гарантированного обеспечения точности по отношению к использованным терминам и цифрам например, к векторам, количествам, температуре и т. Если не указано иначе, то части являются частями по массе, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура выражена в градусах Цельсия и давление является атмосферным или близким к нему.
В некоторых обстоятельствах нацеливание можно проводить одновременно с двойным механизмом детектирования. Пример 1: введение частично человеческой области иммуноглобулина в локус гена V H генома мыши.
Приведенный в качестве примера способ замещения участка генома млекопитающего частично человеческой областью иммуноглобулина показан на фигурах На фигуре 1 приведена схема, показывающая различные стадии данного примерного аспекта способов по изобретению. Затем следует введение второго сайта сайт-специфической рекомбинации в геном млекопитающего, который в сочетании с первым сайтом сайт-специфической рекомбинации фланкирует эндогенную иммуноглобулиновую область.
![Биология. 11 класс](https://m.nkj.ru/upload/iblock/fbd/fbde6b9ab76ed8d32568fa1cfe1e74aa.jpg)
Фланкированная эндогенная область делецируется и вводится синтетическая нуклеиновая кислота, содержащая человеческие и «нечеловеческие» последовательности посредством опосредованного рекомбиназой обмена. Приведенный в качестве примера способ, показывающий введение частично мышиной-человеческой области иммуноглобулина в геномный локус мышиной ES-клетки, более подробно приведен на фигурах Нацеленный вектор содержит кДНК человеческого рецептора дифтерийного токсина hDTR для применения в негативном отборе клеток, экспрессирующих введенную конструкцию, на последующих стадиях.
Нацеленный вектор также необязательно содержит визуальный маркер, такой как флуоресцентный зеленый белок GFP не показан. Нацеленный на гомологичные участки вектор вводится в мышиную ES-клетку, которая имеет иммуноглобулиновую область , содержащую эндогенные гены V H , пре-D-область , область J-гена и область константного гена иммуноглобулиновой области.
На фигуре 3 показана эффективность того же подхода, который приведен на фигуре 2, за исключением того, что добавляется дополнительная группа сайтов сайт-специфической рекомбинации, например сайт Rox и модифицированный сайт Rox для применения с Dre-рекомбиназой.
На фигуре 3 показан нацеленный на гомологичные участки вектор , содержащий слитый белок пуромицин фосфотрансфераза-тимидинкиназа , фланкированный сайтами узнавания рекомбиназы FRT , loxP и Rox и модифицированными сайтами FRT , loxP и Rox , которые не способны рекомбинировать соответственно с немодифицированными сайтами , и Нацеленный на гомологичные участки вектор вводится в мышиную иммуноглобулиновую область , которая содержит эндогенные гены V H , пре-D-область , область J-гена и область константного гена иммуноглобулиновой области.
Как показано на фигуре 4, обеспечивается второй нацеленный на гомологичные участки вектор , содержащий миниген гипоксантинфосфорибозилтрансферазы HPRT и ген резистентности к неомицину , и сайты узнавания рекомбиназы FRT , loxP для Flp и Cre, которые обладают способностью рекомбинировать с сайтами FRT и loxP , интегрированными с помощью первого нацеленного на гомологичные участки вектора.
Нацеленный на гомологичные участки вектор вводится в модифицированную мышиную иммуноглобулиновую область, которая содержит эндогенные гены V H , пре-D-область , область J-гена и область константного гена После того как сайты рекомбинации введены в геном млекопитающего-хозяина, эндогенная область иммуноглобулинового домена затем подвергается рекомбинации введением одной из рекомбиназ, соответствующих сайтам сайт-специфической рекомбинации в геноме, в данном примере рекомбиназ FLP или Cre.
Способ зависит от второй нацеленности, которая скорее будет иметь место в той же хромосоме, чем в ее гомологе то есть в цис-положении, а не в транс-положении. Если нацеленность имеет место в транс-положении, то клетки не будут чувствительными к негативному отбору после Cre-рекомбинации.
ES-клетки с делецированной иммуноглобулиновой областью можно отобрать негативной селекцией с использованием гена hDTR. На фигуре 6 показано введение частично человеческой последовательности в модифицированный мышиный геном. Сайт-специфический нацеленный вектор, состоящий из частично человеческой области иммуноглобулина, содержит i область V H , содержащую 44 человеческих кодирующих областей V H и промежуточные последовательности, основанные на мышиных геномных эндогенных последовательностях; ii пре-DJ-область размером 10 т.
Частично человеческая область иммуноглобулина фланкирована сайтами рекомбинации , , и , что позволит происходить рекомбинации с модифицированным эндогенным локусом. После введения соответствующей рекомбиназы частично человеческая область иммуноглобулина интегрируется в геном выше области константного гена Делеция гена HPRT в качестве части рекомбинантного события позволит идентифицировать клетки, которые не подверглись рекомбинантному событию с использованием 6-тиогуанин-зависимого негативного отбора.
Пример 2: введение частично человеческой области иммуноглобулина в геном мыши. В некоторых аспектах частично человеческая область иммуноглобулина будет содержать элементы, описанные в примере 1, но с наличием дополнительных последовательностей, например последовательностей, добавленных в стратегических целях для введения дополнительных регуляторных последовательностей, для гарантии обеспечения требуемого пространственного распределения во введенной иммуноглобулиновой области, для того чтобы некоторые кодирующие последовательности находились в адекватном соседнем расположении с другими последовательностями, смежными с замещенной областью иммуноглобулина и тому подобное.
На фигуре 7 показано введение второй примерной частично человеческой последовательности в модифицированный геном мыши, полученный, как показано на фигурах и описано в примере 1 выше. Сайт-специфический нацеленный вектор, содержащий частично человеческую область иммуноглобулина, включает i область V H , содержащую человеческих кодирующих областей V H и промежуточные последовательности, основанные на эндогенных последовательностях мышиного генома; ii пре-DJ-область размером 10 т.
Частично человеческая область иммуноглобулина фланкирована сайтами рекомбинации , , и , что позволяет происходить рекомбинации с модифицированным эндогенным локусом. После введения соответствующей рекомбиназы частично человеческая область иммуноглобулина интегрирует в геном выше области константного гена Пример 3: введение частично человеческой области иммуноглобулина в локус гена тяжелой цепи иммуноглобулина мышиного генома.
Способ замещения участка генома млекопитающего частично человеческой областью иммуноглобулина показан на фигуре 8. В данном способе использовали введение первого сайта сайт-специфической рекомбинации в геном млекопитающего с последующим введением второго сайта сайт-специфической рекомбинации в геном млекопитающего. Фланкированную эндогенную область делецировали с использованием соответствующей сайт-специфической рекомбиназы, как описано в данном документе.
Нацеленные векторы , , использованные для введения сайтов сайт-специфической рекомбиназы, с каждой стороны кластера сегментов генов V H -, D H - и J H -областей, в области мышиного иммуноглобулина дикого типа , содержали дополнительный сайт сайт-специфической рекомбиназы, который был модифицирован таким образом, что он по-прежнему эффективно распознавался рекомбиназой, но не рекомбинировал с немодифицированными сайтами.
Данный сайт располагался в нацеленном векторе таким образом, что после делеции кластера сегментов генов V H -, D H - и J H -областей он не мог использоваться для второго сайт-специфического рекомбинационного события, в котором ненативный фрагмент ДНК продвигался в модифицированный локус V H.
Способ продвижения ДНК в локус с использованием сайт-специфической рекомбиназы относится в данном документе к «обмену экспрессионными кассетами, опосредованному рекомбиназой». В данном примере ненативная ДНК представляла собой синтетическую нуклеиновую кислоту, содержащую человеческие и «нечеловеческие» последовательности.
Конструировали два ген-нацеленных вектора для осуществления только что описанного способа. Другой вектор содержал мышиную геномную ДНК, отобранную внутри локуса вблизи сегментов гена J-области.
Колонии резистентных к препарату ES-клеток физически извлекали с чашек после того, как они становились видимыми невооруженным глазом через неделю.
Собранные колонии разделяли, повторно высевали в микролуночные планшеты и культивировали в течение нескольких суток. Затем каждый из клеточных клонов разделяли таким образом, чтобы часть клеток можно было заморозить в качестве архивного материала, а остальные использовали для выделения ДНК для проведения аналитических исследований.
Первая из них давала в целом два позитивных клона примерно из клонов, подвергшихся скринингу, с использованием четырех анализов ПЦР. Вторая давала в целом 6 позитивных клонов, также примерно из клонов, подвергшихся скринингу.
![Вы точно человек?](https://aif-s3.aif.ru/images/019/401/76da233e3006ba686bba67ee62b0eb58.jpg)
В целом из двух трансфекций было отобрано шесть ПЦР-позитивных клонов для размножения с последующим дополнительным анализом с использованием саузерн-блоттинга. Саузерн-блоттинг проводили согласно широко используемым протоколам с использованием трех зондов и геномной ДНК, расщепленной многочисленными рестриктазами, выбранными таким образом, чтобы комбинация зондов и гидролизатов позволяла идентифицировать структуру нацеленного локуса в клонах как правильно модифицированную в результате гомологичной рекомбинации.